Ses premières recherches, portant sur la cristallographie, sont à l'origine de la stéréochimie. Puis il étudie les fermentations lactique, alcoolique et butyrique et décèle qu'elles sont dues chacune à un ferment spécifique. Il découvre les bactéries anaérobies, ce qui l'amène à démontrer que la génération spontanée des germes n'existe pas. En 1865, ses travaux sur le ver à soie et sa maladie (pébrine) sauvent la sériciculture. Entre 1870 et 1886, il met en évidence de nombreux germes (staphylocoque, streptocoque...), causes de maladies infectieuses, et met au point un procédé de conservation des bières (pasteurisation). En 1881, avec Roux, il commence ses études sur la rage. En 1885, il met au point un vaccin contre cette maladie, qui lui vaut la célébrité.
